生物TEM组织取材步骤及注意事项

2023-07-03 17:36 检测知识

  1、定位准确:取材部位解剖水平的准确定位要求误差应 ≤ 1mm。注意各组实验动物组织取材区位及方位的一致性和代表性。

  2、操作迅速:组织离开活体后,以速度浸入醛类固定液,0.5 min或2 min。 先准备好2mlEP管,里面盛满预冷的醛类固定液。提示:在解剖前做灌注固定,而对脑、脊髓、睾丸等组织则必须做灌注固定。

  3、标本尺寸大小:组织块的粒径大小必须与固定液的穿透率(≤0.5mm)相适应,样品块过大,内部固定不良;样品过小,观察内容受限。可参照下图取材。提示:把较大标本块修整成符合要求的形状时,须事先准备一个蜡盘,滴入醛类固定液,把标本浸在液滴中修整,确认每个小标本条都包含需要的结构内容,再用牙签挑出三小块,放入2ml EP管,密闭,4℃保存。

  4、操作轻柔、清洁:取材操作动作始终保持轻柔,尽可能避免金属器具对组织的夹持、挤压或牵拉,所用器具必须清洁,使用缓冲液清洗。

  5、保持低温环境:为降低自溶酶活性,在4℃低温条件下取材,容器和器械预冷;将修整好的标本块放入醛类固定液后,4℃冰箱保存。

  提示:

  ❶初固定之后,尽早进入制备程序;存放3天以上,须更换固定液。

  ❷注意:既要保持低温,又要避免EP管接触冰块,固定液 要充满标本小瓶,盖紧瓶盖,用胶布加固,以免邮寄途中液体渗出。

  为了得到精美的TEM照片,请务必认真做好关键的第一步取材!

  1、确认细胞数量≥105,根据研究目的,选择取材时间;

  2、调整醛类固定液pH与培养基pH相同并等渗;

  3、贴壁细胞用柔软细胞刮子轻轻刮起,成细胞悬液;

  4、把细胞悬液置入洁净离心管,或圆底EP管(2ml);

  5、选择合适的离心速度和时间,3000-5000转,5~10分钟,形成细胞团块;

  6、用牙签轻轻挑起细胞团块,若致密柔韧,即弃上清,注入新鲜醛类固定液,4℃保存;

  7、及时送实验室,进入电镜样品制备程序。

  提示:

  A.取离心好的细胞团块时,如细胞分散开,可在离心管中注入约5μl血清再离心,至EP管底部出现致密细胞团块。

  B. 细胞大小不同,离心富集速率和时间不同。事先检索文献,避免反复离心损伤细胞。

  C. 在上述第(5)步骤之前,用缓冲液离心1~2次,可以清除培养基中的杂质。但此 操作要注意:缓冲液要新鲜,缓冲液与培养基等渗,pH近似。由于各实验室配制缓冲液方法和保存时间等差别很大,由缓冲液欠佳带来的损伤不容忽视,请使用前斟酌。

  D. 快递标本注意:

  ❶4℃保存;

  ❷避免标本瓶直接接触冰块;

  ❸固定液要充满样品容器,确认盖紧瓶盖,用胶布加固,以免邮寄途中液体渗出(此种情况常见)。